Ультрацентрифугирование: суть метода и более эффективные аналоги

На протяжении десятилетий ультрацентрифугирование являлось ключевым инструментом научно-исследовательских работ в молекулярной биологии и биохимии. Метод помог совершить многие революционные прорывы, затем пережил потерю популярности и возрождение интереса на рубеже веков. Сегодня технология продолжает занимать достойное место в ряду средств изучения сверхмалых частиц.

Суть метода ультрацентрифугирования и его роль в биофармацевтике

В основе метода лежит седиментация – осаждение под действием центробежной силы частиц дисперсной фазы, распределенных в жидкой среде. На скорость седиментации твердых частиц в суспензии либо жидких капель вещества в эмульсии влияют их физико-химические свойства, а также вязкость и плотность растворителя. Именно на этом обстоятельстве и базируются экспериментальные опыты.

В 1913 году русский химик Думанский попытался определить размер сверхмалых частиц в коллоидном растворе на обычной лабораторной центрифуге, однако потерпел неудачу. Выяснилось, что центрифугирование в этом случае не позволяет обеспечить требуемые параметры центробежного ускорения из-за недостаточной скорости вращения.

Спустя 10 лет успеха добился Теодор Сведберг, профессор химии из университета в шведском городе Уппсала, сконструировавший первую высокоскоростную ультрацентрифугу. Заслуги Сведберга в этой области отмечены Нобелевской премией, его именем назван коэффициент седиментации (она же константа седиментации) и единица измерения этого показателя.

Метод ультрацентрифугирования используется для разделения компонентов вещества и исследования высокомолекулярных соединений, структур с клеточным строением, неклеточных организмов – вирусов. С помощью ультрацентрифуги удается определить молекулярную массу и размеры частиц менее 100 нм, плотность и форму макромолекул.

Этот метод сыграл значительную роль в изучении ДНК, помог доказать полуконсервативный механизм редупликации ДНК, привел к открытию бактериальных рибосом. В ходе экспериментов были установлены седиментационные характеристики многих белков, в том числе гемоглобина, миоглобина и гемоцианина.

Ультрацентрифугирование сформировало современные представления о процессах биосинтеза белка. Метод оказался незаменимым и при изучении механизмов регуляции ферментативных реакций.

Классификация ультрацентрифугирования

Существует два типа ультрацентрифугирования – аналитическое и препаративное. Аналитическое используется для изучения седиментационных свойств, цель таких исследований – получение информации о молекулярной массе, структуре, чистоте и других характеристиках образца. Препаративное более распространено, применяется для очистки веществ и выделения отдельных компонентов в концентрированном виде.

Различия в параметрах процесса

Аналитические методы определения характеристик

По скорости седиментации. Ультрацентрифугирование осуществляется на очень больших скоростях, что приводит к образованию четкой границы между зоной седиментации частиц и свободного от них растворителя. Перемещение границы позволяет выяснить скорость седиментации, на основании которой рассчитывается молекулярная масса. Этот метод исследования на аналитической ультрацентрифуге используется чаще остальных.

По седиментационному равновесию. Метод служит для определения молекулярной массы по градиенту концентрации в случаях, когда частицы слишком малы и не осаждаются при достижимом максимальном ускорении. Процесс идет с относительно небольшой скоростью вращения, пока в результате установления равенства центробежных и диффузионных сил частицы не перестанут перемещаться. Основной недостаток – чересчур длительное время центрифугирования, которое может составлять до нескольких недель.

По приближению к седиментационному равновесию. В сравнении с предыдущим этот метод более быстрый, но менее точный. В ходе центрифугирования отслеживают изменение во времени градиента концентрации, который используется для расчетов молекулярной массы.

Методы препаративного ультрацентрифугирования

Дифференциальный. Цель операции – поэтапное осаждение частиц, различающихся размером и плотностью, путем ступенчатого увеличения центробежного ускорения и времени центрифугирования. После каждого этапа от осадка отделяют надосадочную жидкость – супернатант, с которым совершают повторные действия. Самый популярный в лабораториях и промышленной практике метод ультрацентрифугирования.

Зонально-скоростной. Метод заключается в центрифугировании в градиенте плотности, операция завершается за один этап. Частицы при разделении на фракции перемещаются по раствору и формируют дискретные полосы, как в слоистом коктейле «Светофор». Работы с образцом ведутся в градиенте плотности, что обеспечивает высокую эффективность разделения, в том числе при содержании в растворе близких по размеру и плотности частиц.

Изопикнический. Этот метод, как и предыдущий, основан на ультрацентрифугировании в градиенте плотности. Частицы осаждаются до того момента, пока их плавучая плотность не станет соответствовать плотности растворителя, и остаются в этом положении даже после остановки оборудования.

Принцип работы ультрацентрифуги

Отобранная проба с растворенным веществом помещается в пробирку и устанавливается в роторе ультрацентрифуги. При круговом вращении ротора возникает центробежная сила, под действием которой частицы устремляются в радиальном направлении, ко дну пробирки. Центробежное ускорение в ультрацентрифуге в сотни тысяч раз больше ускорения свободного падения, что позволяет осаждать даже ионы.

Компоненты с разной константой седиментации при осаждении формируют отдельные слои. Регулировкой скорости вращения ротора, а также вязкости и плотности среды при помощи ультрацентрифуги добиваются результатов, получить которые в иных условиях оказалось бы затруднительно.

Характерные особенности процесса:

1. При одинаковой плотности более крупные частицы седиментируют гораздо быстрее мелких.
2. Скорость осаждения пропорциональна плотности частиц, что особенно заметно проявляется, если плотности частиц и растворителя близки по значению. Реальной при седиментации является ситуация, когда мелкие частицы с большей плотностью осаждаются быстрее крупных.
3. Отклонение формы частиц от сферической тоже сказывается на скорости осаждения, хотя и незначительно.
4. Скорость седиментации пропорциональна квадрату числа оборотов ротора.
5. В более вязкой среде частицы седиментируют медленнее.
6. Скорость осаждения пропорциональна расстоянию между частицей и осью вращения ротора. По мере продвижения частицы в направлении дна пробирки расстояние увеличивается, поэтому при прочих равных скорость осаждения постоянно растет. Если данное явление признано нежелательным, продвижение компенсируется за счет увеличения плотности и вязкости растворителя в радиальном направлении. Результат достигается созданием нарастающего градиента плотности и показателя вязкости среды.

Ионы и молекулы, присутствующие в растворе, могут создавать прочные связи с частицами, чья эффективная плотность тем самым уменьшается или увеличивается. По этой причине для конкретных частиц, помещенных в определенный растворитель, вводят понятие плавучей плотности. Данный параметр, а также плотность и вязкость растворителя зависят еще и от температуры среды.

Конструкция и устройство ультрацентрифуги

Оборудование представляет собой герметичную камеру с ротором с креплениями для пробирок, который приводится в действие электродвигателем. Камера изготавливается из брони, чтобы защитить оператора при разрыве ротора центробежной силой.

На выбор ротора влияет избранный метод ультрацентрифугирования и условия поставленной задачи – объем центрифугируемой жидкости, константа седиментации и потребность в сокращении времени центрифугирования. Алюминиевые роторы легче, с ним проще работать, титановые прочнее и более устойчивы к коррозии.

Типы роторов:

• Угловые. Удобны при быстром отборе тяжелых фракций и зональном ультрацентрифугировании, наиболее полезны при осаждении и выделении ДНК изопикническим методом.
• С подвесными стаканами (бакетные). Великолепно показывают себя при зонально-скоростном разделении частиц и получении компактного осадка, например при седиментации РНК сквозь слой хлорида цезия.
• С вертикальными пробирками. Рассчитаны на исследования в условиях, когда большое значение придается уменьшению времени центрифугирования.
• Для проточного ультрацентрифугирования. Больше других роторов подходят для фракционирования больших объемов вещества.
• Для зонального ультрацентрифугирования (роторы Андерсона). По сфере применения аналогичны роторам предыдущего типа, используются для разделения частиц в градиенте плотности.

В современных ультрацентрифугах скорость вращения роторов может превышать 100 тысяч оборотов в минуту, в воздушной среде это вызовет сильный разогрев ротора из-за трения. Чтобы этого не случилось, в камере создается вакуум либо атмосфера разреженного водорода. Для откачки воздуха используется форвакуумный насос, который во многих моделях комбинируется с диффузионным масляным насосом. Камера дополнительно оснащается термоэлектрической или твердотельной системой охлаждения.

В оборудовании для высокоскоростного аналитического центрифугирования обязательно присутствует оптическая система, которая дает возможность наблюдать за седиментацией, автоматически регистрировать результаты и вести фотосъемку процесса. Встречаются разные виды оптических систем – ультрафиолетовая абсорбционная, шлирен-система, интерферометр Рэлея.

Общий перечень выпускаемой техники всех типов включает в себя напольные и настольные модели, а также микроультрацентрифуги.

Области применения

Биохимия. Определение конформационных изменений в макромолекулах, оценка гомогенности и формы образца, очистка белков. Лигандный анализ взаимодействия химических соединений с белком. Обнаружение и выделение ДНК и РНК, субклеточных органелл, микросом.

Медицина. Выделение экзосом и липопротеинов при исследовании крови, мочи и других биологических жидкостей. Отделение хиломикронов и быстрая очистка липемичных образцов крови.

Фармацевтика. Подбор состава и оценка чистоты лекарств с активными фармацевтическими ингредиентами. Получение векторов для производства генотерапевтических препаратов. Изучение эффективности конъюгации антител с лекарственными средствами.

Вирусология. Анализ на вирусную нагрузку в организме. Очистка вирусных частиц перед выделением генома.

Сравнительный анализ технологий ультрацентрифугирования и тангенциальной фильтрации

Тангенциальная фильтрация с помощью мембран (TFF) – более современный метод очистки и концентрирования биологических продуктов. Технология нацелена на тот же круг задач, что и ультрацентрифугирование, но ее возможности в отношении эффективности, экономичности и масштабируемости гораздо выше. Среди зарекомендовавших себя систем тангенциальной фильтрации присутствует и продукция компании Challenge IM, которую предлагает VM-Solutions.

1. Производительность и время обработки

Системы Challenge IM демонстрируют значительное преимущество в скорости обработки образцов. В то время как стандартный цикл ультрацентрифугирования занимает 6–12 часов (в зависимости от объема и типа образца), тангенциальная фильтрация позволяет сократить это время до 2–4 часов. Например, при концентрировании моноклональных антител Challenge IM показывает стабильную производительность 80-120 л/м2/ч, тогда как ультрацентрифуге требуется значительно больше времени, чтобы достичь аналогичных параметров концентрации.

2. Сохранение продукта

Веским преимуществом Challenge IM является более высокий выход продукта – от 95 до 98% по сравнению с 85–90% при ультрацентрифугировании. Результат достигается за счет:

• Минимального стресса для белковых молекул (отсутствие больших центробежных сил)
• Снижения риска образования агрегатов
• Возможности точного контроля параметров процесса в реальном времени

3. Масштабируемость и автоматизация

В отличие от ультрацентрифуг, которые требуют сложной процедуры балансировки и имеют ограничения по объему обработки, системы Challenge IM легко масштабируются от лабораторных до промышленных объемов. Важное преимущество – возможность полной автоматизации процесса, включая:

• Автоматическую промывку мембран
• Контроль параметров через SCADA-системы
• Интеграцию с другими этапами биопроизводства

4. Экономическая эффективность

Анализ совокупной стоимости владения показывает, что Challenge IM обеспечивает:

• На 30–40% меньшие эксплуатационные расходы
• Снижение энергопотребления в 2–3 раза
• Возможность многократного использования мембран (до 50 циклов)
• Меньшие требования к площадям и инфраструктуре

5. Гибкость применения

Там, где ультрацентрифуги требуют подбора конкретных роторов и пробирок для каждого типа образцов, Challenge IM предлагает универсальное решение для:

• Концентрирования
• Диафильтрации
• Буферного обмена
• Вирусной очистки

Продукция Challenge IM используется в биофармацевтике для очистки моноклональных антител и вакцин, производства препаратов для клеточной и генной терапии. Предлагаемые системы тангенциальной фильтрации совместимы с разными типами мембран, включая керамические.

Компания VM-Solutions выступает официальным поставщиком оборудования Challenge IM. Мы готовы разработать проект плавного переход с ультрацентрифуг на современные методы фильтрации биопродуктов на вашем производстве и сделать расчет экономического эффекта от внедрения.

Преимущества тангенциальной фильтрации перед ультрацентрифугированием

Тангенциальная фильтрация с помощью мембран (TFF) – более современный метод очистки и концентрирования биологических продуктов. Технология нацелена на тот же круг задач, что и ультрацентрифугирование, но ее возможности в отношении эффективности, экономичности и масштабируемости гораздо выше.

В чем плюсы тангенциальной фильтрации:

• Сокращение времени обработки образцов в несколько раз
• Более высокий выход продукта (95–98% по сравнению с 85–90% при ультрацентрифугировании)
• Универсальность решений вместо подбора конкретных роторов и пробирок для каждого типа образцов
• Легкое масштабирование от лабораторных до промышленных объемов
• Возможность полной автоматизации процесса
• Уменьшение эксплуатационных расходов на 30–40%, снижение энергопотребления в 2–3 раза, меньшие требования к площадям и инфраструктуре
• Возможность многократного использования мембран (до 50 циклов)

В число ведущих разработчиков и производителей систем тангенциальной фильтрации для биофармацевтики входит компания Challenge IM. Продукция предприятия используется в очистке моноклональных антител и вакцин, производстве препаратов для клеточной и генной терапии. Предлагаемые системы тангенциальной фильтрации совместимы с разными типами мембран, включая керамические.

Компания VM-Solutions выступает официальным поставщиком оборудования Challenge IM. Мы готовы разработать проект плавного переход с ультрацентрифуг на современные методы фильтрации биопродуктов на вашем производстве и сделать расчет экономического эффекта от внедрения.